植物是生物质的主要生产者，包括碳水化合物，蛋白质，脂质，纤维素和其他。植物蛋白质包括酶、调节和结构蛋白质，在调节植物生长和发育中发挥重要的生物学作用。植物蛋白在细胞内合成然后转运到不同的亚细胞位置，包括细胞外空间或基质，以发挥它们的生物学功能。这个过程通常被称为蛋白质分选和靶向(Foresti and Denecke, 2008; Rose and Lee, 2010)。植物细胞含有细胞壁，质膜，叶绿体，线粒体，大液泡，细胞核，内质网(ER)，高尔基体，过氧化物酶体，胞质溶胶等。膜蛋白可以嵌入或连接到质膜、细胞器膜或内膜系统。

真核生物中蛋白质亚细胞位置的鉴定和分析是注释蛋白质组的重要课题之一。在植物物种中，分泌到细胞外空间或基质(包括细胞壁)的蛋白质统称为“分泌蛋白” (Agrawal et al., 2010; Lum and Min, 2011a)。这一术语最初由Tjalsma等(2000)提出，表示由分泌途径加工的枯草芽孢杆菌完整的蛋白质组，其包括分泌到细胞外空间以及参与途径的蛋白质。但实际上往往有所限制，比如这项工作中仅表示蛋白质组包括细胞壁蛋白分泌的胞外部分(e.g., Greenbaum et al., 2001; Hathout, 2007; Bouws et al., 2008; Agrawal et al., 2010; Lum and Min, 2011b)。植物分泌组蛋白主要由细胞壁蛋白、参与细胞壁代谢的蛋白质以及涉及病原体防御的胞外酶和信号分子组成(Isaacson and Rose, 2006; Kamoun, 2009; Lum and Min, 2011a)。分泌酶，特别是水解酶如α-淀粉酶和α-葡糖苷酶，已经使用发芽大麦种子作为模型系统进行了充分研究。这些水解酶在糊粉层中合成并分泌到胚乳中以分解淀粉和其他储存物(Ranki and Sopanen, 1984; Jones and Robinson, 1989; Finnie et al., 2011 for review)。最近，蛋白质组学分析技术以及拟南芥和水稻基因组完整的测序的进展产生许多分泌的蛋白质，包括检测到的细胞壁蛋白质组(Boudart et al., 2007; Agrawal et al., 2010; Lum and Min, 2011a)，这些鉴定的分泌蛋白主要由拟南芥中的细胞壁蛋白(see Jamet et al., 2008 for review)和诸如参与病原体防御的酶GLP1(Oh et al., 2005)组成。使用叶或种子细胞悬浮培养，分泌蛋白用2D凝胶电泳结合水稻、苜蓿和高粱的液相色谱质谱分析鉴定(Jung et al., 2008; Kusumawati et al., 2008; Cho et al., 2009; Ngara and Ndimba, 2011)。从无菌生长的水稻和拟南芥的幼苗根部分泌物中也鉴定出了大量的分泌蛋白(Shinano et al., 2011; De-la-Pena et al., 2010)。最近用于植物分泌组织研究的实验系统，分析技术和相关的生物信息学工具有了全面的综述(Agrawal et al., 2010; Meinken and Min, 2012; Alexandersson et al., 2013; Kraus et al., 2013; Caccia et al., 2013)。

经典的真核分泌蛋白在N-末端含有将蛋白质导向粗面内质网以完成蛋白质合成然后将其运输到高尔基复合体以获得目标蛋白的分泌信号肽(von Heijne, 1990)。信号肽通常为15~30个氨基酸的长度，经常会在通过内膜系统移位期间被切除。经典分泌的蛋白质可以相对精确地计算预测(Min, 2010)。最近我们分析了UniProtKB / Swiss-Prot数据集中所有人为选择和注释的植物分泌蛋白，发现87％可以被使用的三个预测器预测到含有信号肽(Lum and Min, 2011a)。通过使用新版本的SignalP (SignalP 4.0)结合其他工具，包括用于鉴定跨膜蛋白的TMHMM、用于鉴定内质网腔蛋白的PS-Scan，分泌物预测的准确性可以进一步提高(Min, 2010; Melhem et al., 2013)。

随着测序技术的改进和测序成本的降低，越来越多的植物物种的基因组被完全测序。目前有32个具有完整或原始基因组序列的陆地植物以及73种陆地植物正在进行基因组测序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/gpstat.html)。在植物中还存在组装的表达序列标签(EST)数据，用于鉴定超过200种物种中编码分泌蛋白的潜在基因(PlantGDB, http://www.plantgdb.org/prj/ESTCluster/) (Duvick et al., 2008)。

作为基因组测序的结果，可用蛋白质序列的数量迅速增加。除了经典的分泌蛋白之外，还在植物中鉴定了大量无铅，非经典，即不具有分泌信号肽的分泌蛋白(LSP) (Jung et al., 2008; Agrawal et al., 2010; Ding et al., 2012 for review)。这些蛋白质没有在UniProtKB中创建，因此，需要有一个中心知识库为植物研究界提供植物蛋白亚细胞位置以获取可用的信息并为新表征的蛋白质沉积实验证据。为了提供这样的中心植物分泌物相关资源门户，我们开发了植物分泌蛋白组和亚细胞蛋白质组知识库(PlantSecKB) (http://proteomics.ysu.edu/secretomes/plant.html)，包括来自植物蛋白酶的预测、人为选择的蛋白质亚细胞位置以及来自植物EST数据的预测蛋白质。我们的重点是植物分泌蛋白，但是还提供了位于其他亚细胞位置的蛋白质信息。可以通过数据库界面访问用于植物蛋白亚细胞位置的人为选择管理的工具。

1数据库构造方法

1.1数据采集

PlantSecKB主要用从两个来源获得的序列数据构建：从UniProtKB提取的植物蛋白序列(2013-04发布) (http://www.uniprot.org/)，从PlantGDB编译的EST数据组合中预测的蛋白质序列(http://www.plantgdb.org/prj/ESTCluster/)。最近从圣莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)中预测的基因组蛋白也被整合到该数据库中(Ming et al., 2013; Lum et al., 2013)。EST数据中的蛋白质序列使用具有针对UniProt / Swiss-Prot数据库的BLASTX输入的OrfPredictor工具预测(http://proteomics.ysu.edu/tools/OrfPredictor.html)，TargetIdentifier (http://proteomics.ysu.edu/tools/TargetIdentifier.html)用于检查EST是否是全长的(Min et al., 2005a, 2005b)。

1.2用于预测蛋白质亚细胞位置的计算方法

本研究中使用的软件工具包括SignalP 3.0和4.0、TargetP、Phobius、WoLF PSORT、TMHMM、PS-Scan和FragAnchor。这些工具和参考的相关网站链接可以在我们的网站中找到(http://proteomics.ysu.edu/tools/subcell.html)。除了Frag Anchor，我们使用安装在本地Linux系统上的独立工具进行数据处理。有关运行它们的命令可以在每个下载的软件包中的“readme”页面中找到，Lum和Min进行了总结(2013)。简言之，SignalP 4.0用于分泌信号肽的预测(Petersen et al., 2011)。也包括了来自SignalP 3.0的预测信息(Bendtsen et al., 2004b)因为其提供比SignalP 4.0更准确的切割位点预测(Petersen et al., 2011)。Phobius是一个组合的信号肽和跨膜拓扑预测(Käll et al., 2007)。靶标预测用于预测在N-端存在例如信号肽(SP)、叶绿体转运肽(cTP)或线粒体靶向肽(mTP)的信号序列(Emanuelsson et al., 2000; Emanuelsson et al., 2007)。TMHMM使用隐马尔可夫模型(HMM)来预测跨膜螺旋的存在和拓扑及其对膜的定向(进/出) (Krogh et al., 2001)。PS扫描用于扫描PROSITE数据库(http://www.expasy.org/tools/scanprosite/)以去除ER靶向蛋白(Prosite: PS00014) (de Castro et al., 2006; Sigrist et al., 2010)。FragAnchor用来鉴定通过SignalP 4.0预测含有信号肽的蛋白质中的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白(GAP) (Poisson et al., 2007)。WoLF PSORT可以预测多种亚细胞位置，包括胆石、胞质溶胶、细胞骨架、ER、胞外(分泌的)、高尔基体、溶酶体、线粒体、核、过氧化物酶体、质膜和液泡膜(Horton et al., 2007)。真核生物或植物的默认参数(如果可用)用于所有程序。我们先前的评估发现，用于植物分泌组织预测的WoLF PSORT会由于预测灵敏度的显著降低而导致准确度降低(Min, 2010)。因此，其不用于分泌物预测，仅用于预测一些其它亚细胞位置。

关于分配蛋白质的亚细胞位置，UniProtKB注释的亚细胞位置和我们的人为选择优先于计算预测，因此，只对没有注释的亚细胞位置的蛋白质进行亚细胞位置的计算分配。所有工具产生的信息仍然可用于所有植物蛋白质。一些蛋白质可以具有一个以上亚细胞位置，以下标准用于蛋白质亚细胞位置的计算分类：

膜蛋白：通过TMHMM预测含有一个或多个跨膜结构域的蛋白质。但是，如果仅预测到一个跨膜结构域，位于N-末端70个氨基酸内，并且被SignalP4.0预测为信号肽，则该蛋白质不被视为膜蛋白。

叶绿体蛋白：被TargetP预测为“C”(对于叶绿体)用于亚细胞定位的蛋白质。如果它也被归类为膜蛋白，则其被进一步分类为叶绿体膜蛋白。

线粒体蛋白：由TargetP预测为亚型细胞定位的“M”(线粒体)的蛋白质。如果它也被分类为膜蛋白，则进一步分类为线粒体膜蛋白。

ER蛋白：通过SignalP 4.0预测含有信号肽的蛋白质和通过PS扫描含有EHR靶标信号(Prosite：PS00014)。

完整的分泌组蛋白：来自一个物种的所有的分泌蛋白。通过所有三个预测SignalP 4.0、Phobius和TargetP预测具有分泌信号肽并且不被分类为任何上述类别的蛋白质，未分类为任何上述类别并且被一个或两个预测器预测为的信号肽的蛋白质被认为“弱可能分泌的”或“可能分泌的”，因为我们先前的评估揭示信号肽在一些注释的分泌蛋白质中只能被一个或两个预测器检测到(Lum and Min, 2011a)。联合使用三个预测器可以增加分泌物预测的特异性，提高预测准确性(Min, 2010; Melhem et al., 2013)。所有人为选择的卷曲分泌蛋白和细胞外蛋白质包括在完整分泌蛋白中。

卷曲分泌蛋白：该类别包括在来自UniProtKB / Swiss-Prot数据集的“审查”的亚细胞位置中注释为“分泌型”或“细胞外”或“细胞壁”的蛋白质，它还包括我们从最近的文献中人工手机的分泌蛋白。

GPI锚定蛋白：被Frag Anchor预测具有GPI锚含信号肽的蛋白质进一步分类为GPI锚定蛋白。预测具有信号肽和GPI锚的蛋白质序列可附着于质膜的外部小叶或分泌成为细胞壁的组分。这些蛋白质参与信号传导、粘附、应激反应、细胞壁重塑或在生长和发育中发挥其他作用(Borner et al., 2002; Borner et al., 2003; Gillmor et al., 2005; Simpson et al., 2009)。

其他亚细胞位置的蛋白质：由WoLF PSORT预测的其它亚细胞位置包括细胞质(细胞质)、细胞骨架、高尔基体、溶酶体、细胞核、过氧化物酶体、质膜和液泡。

1.3蛋白质亚细胞位置的计算预测精度

我们上面使用的预测方法的开发是基于我们以前对计算工具的评估(Min, 2010; Meinken and Min, 2012; Melhem et al., 2013)。为了估计我们的方法对每个亚细胞定位的预测精度，我们使用了两个数据集(表1)。数据集A由15 028个蛋白组成，该数据集包含来自具有人为选择亚细胞位置的UniProtKB / Swiss-Prot数据集的蛋白质，排除具有多个亚细胞位置或标记为“片段”的蛋白质。数据集B由6 908个蛋白组成，这些蛋白在排除在亚细胞位置注释中具有术语“通过相似性”或“可能”或“预测”的条目之后从数据集A生成。与使用单个工具的其他方法相比，我们的方法是使用多种工具的组合，包括SignalP 4.0、TargetP和Phobias用于分泌信号肽预测、PS扫描用于去除ER蛋白和用TMHMM用于去除膜蛋白，显著提高了分泌信号肽的预测准确性(Min, 2010; Meinken and Min, 2012)。对于数据集A的分泌组蛋白预测，我们的方法达到91.1％的灵敏度，98.7％的特异性和88.5％的Mathews相关系数(MCC)，对于数据集，灵敏度为76.8％，特异性为98.9％，MCC为74.5％。这比单独使用WoLF PSORT或MultiLoc好得多(Meinken and Min, 2012)，因此，分泌蛋白的预测是相对可靠的。预测其他亚细胞位置的准确性仍需要改进。

表 1 植物蛋白亚细胞定位预测精度的评价; Evaluation of prediction accuracies of plant protein subcellular locations

1.4人工管理和团体注释

基于已发表的实验证据，PlantSecKB为植物蛋白亚细胞位置的管理提供支持。一个为团队服务的提交工具被开发用来提供蛋白质的亚细胞位置注释以及支持它的注释文献来源。经过我们的验证，这些数据也被合并到数据库中。目前，根据已发表的实验数据，我们从水稻(Jung et al., 2008; Cho et al., 2009; Cho and Kim, 2009; Chen et la., 2009; Zhang et al., 2009; Shinano et al., 2011)，拟南芥(De-la-Pena et al., 2010)和高粱(Ngara et al., 2011)中人为选择了736个分泌蛋白。人为选择是一个持续的过程，因此，来自我们和其他团队的更多的分泌蛋白将被人为选择并整合到数据库中。来自计算预测、UniProtKB注释和人为选择的信息被集成并显示在注释页面上(图1)。注释的条目被链接到所使用的工具、UniProtKB、RefSeq数据库和国家生物技术信息中心(NCBI)的PubMed上。

图 1 PlantS eKB用户界面和注释页面概述; Overview of the PlantSecKB user interface and annotation page

 

2数据库内容和工具概述

2.1数据和工具访问

PlantSecKB通过数据库网页http://proteomics.ysu.edu/secretomes/plant.php界面访问。该界面提供了用于搜索从UniProtKB获取的蛋白质的各种实用程序，指向BLAST的链接、EST数据搜索页面和注释页面(图1)。可以使用UniProt登录号(AC)或ID、基因名称、蛋白质功能或物种的关键词来搜索UniProt包含的所有植物蛋白。亚蛋白质组包括卷曲分泌蛋白、完全分泌蛋白、线粒体膜蛋白、OR蛋白以及其他可以通过从物种列表中选择具有大于1 000个蛋白质序列搜索或下载的其他物种。可以通过输入物种名称来搜索具有少于1000个蛋白质条目的种类。可以通过界面上的链接访问BLAST实用程序来搜索所有植物蛋白或分泌物，该界面还提供指向EST数据搜索页面的链接，可以使用EST标识符，关键字，种或BLAST进行搜索。

每个UniProt蛋白质的注释显示页面包含从以下三个来源获得的信息：(1)使用上述七个程序的计算方法预测的特征；(2)在UniProtKB中注释的亚细胞位置；(3)我们根据最新文献的实验依据进行的人为选择。数据库特性的概述如图1。人为选择的分泌蛋白由从UniProtKB / Swiss-Prot检索亚细胞位置标记为“审查”以及人为策划的蛋白质组成。来自内部治疗和团体的选择的蛋白质由其亚细胞位置注释和相关文献的实验依据支持。注释页面还包含主要蛋白质序列(图1)。

EST数据注释包含主要EST序列，使用OrfPredictor预测的蛋白质肽序列(Min et al., 2005a)，基于BLASTX的功能注释，使用目标标识符预测开放阅读框的完整性(Min et al., 2005b)，使用工具生成的亚细胞位置预测相关信息基于预测的蛋白质序列。由于EST数据可能包含在测序和装配中引入的错误，需要小心使用数据。数据库中提供的EST信息将有助于数据挖掘和实验设计以进一步检查所编码蛋白质的基因功能和亚细胞位置。

2.2数据总结

PlantSecKB总共包含1 415 921个蛋白质序列，包括来自UniProt / Swiss-Prot数据集(选择和审查)的33 643个，来自UniProt-TrEMBL(未审查)的含有26 685个从新的圣莲基因序列获得的额外蛋白的1 355 593个(Ming et al., 2013; Lum et al., 2013)。对于具有超过7 000个蛋白的物种，亚细胞蛋白质组学的主要类别总结在表1中，卷曲的分泌蛋白，OR蛋白和溶酶体蛋白未列于表1中。在拟南芥中只预测到7种溶酶体蛋白，其他物种中没有预测到溶酶体蛋白。共有2 774个卷曲分泌蛋白，其主要获自拟南芥和油菜亚种粳稻，分别具有1 247和559个。应当注意的是一个物种的总蛋白质条目是在UniProtKB中收集的数目，因为在一些蛋白质条目中存在一些冗余或重复，其可以大于完整或参照基因组。例如，苜蓿亚种在PlantS中有99 984个条目，在其完整的蛋白质组中只有63 544个条目，and拟南芥在PlantS中有53 847个条目，在UniProtKB完整蛋白质组中只有31 908个条目(http://www.uniprot.org/taxonomy/complete-proteomes)。观察到的总体趋势是具有相对小的蛋白质组的植物具有相对较小数量和相对较低比例的分泌的蛋白，例如在单细胞绿藻中。例如，肠球菌属具有少于100种预测的分泌蛋白(1.2％)，苔藓（Physcomitrella patens）预测到有781种分泌蛋白(2.9％) (表2)。基于我们的预测估计，单子叶植物和双子叶植物的平均蛋白质组占蛋白质组的4.0％~7.5％。在这项报告的蛋白质组百分比略低于我们以前报告，这是因为我们以前的研究使用了SignalP 3.0，而本研究使用了SignalP 4.0，它具有更高的特异性(Lum et al., 2013; Petersen et al., 2011)。

表 2 PlantSecKB中不同植物物种的亚细胞蛋白质组学总结; Summary of subcellular proteomes in different plant species in PlantSecKB

 

预测的9种列于表2中的藻类、单子叶植物和双子叶植物的亚细胞蛋白质组学的平均蛋白质组大小和分布总结在表3中。莲花粳稻，一种双子叶植物，由于其蛋白质组的不完全性，是唯一不用于该分析的物种。绿藻中预测的平均蛋白质组要小得多，所以每个亚细胞蛋白质组仅由较少数量的蛋白质组成(表3)。比较单子叶植物和双子叶植物中分泌蛋白、叶绿体膜蛋白、液泡蛋白和质膜蛋白的分布百分比没有显着差异，但是，预测为线粒体和叶绿体膜蛋白的，单子叶植物具有显著更高比例(包括膜和非膜)；双子叶植物具有显著更多的蛋白质预测为细胞质和核蛋白(表3)，这些观察到的单子叶植物和双子叶植物之间亚细胞蛋白质组分布的差异是由计算工具还是生物本身或进化意义引起的需要进一步研究。

表 3 绿藻，单子叶植物和双子叶植物中亚细胞蛋白质组分布的比较; Comparison of subcellular proteome distribution in green algae, monocot and dicot plants

 
3 Comparative Analysis of Secretomes

3分泌蛋白组的比较分析

植物分泌蛋白或其他亚蛋白质组的完全比较进化分析不在本研究的范围。但是，由于完全分泌蛋白组或其他亚蛋白质组序列可以直接从我们的数据库下载，它将有助于进一步比较研究不同物种中的这些亚蛋白质组。举个例子，我们对包括三种单子叶植物的代表(短柄苋、粳稻、玉蜀黍)、三种双子叶植物(拟南芥、毛果杨、番茄)和两种苔藓(小立碗藓、卷柏)的一组植物进行了分泌蛋白组的比较分析(表4; 表5)。我们使用BLAST中的blastclust工具，在比对中截断95％的同一性以去除或减少冗余，对非冗余或较少冗余的分泌物进行比较。为了提供植物中分泌蛋白的功能的概述，我们对8个选定的植物物种进行了代表性分泌蛋白基因本体(GO)的分析。分泌蛋白组被用来查找具有1e-10的截断E值的BLASTP Swiss-Prot数据集。基因本体(GO)信息从UniProt ID映射数据检索(http://www.uniprot.org/downloads)并使用GO SlimViewer和植物特异性基因本体(GO)术语进行分析(McCarthy et al., 2006)。所选物种分泌蛋白的GO生物过程和分子功能分类的比较总结在表4中。植物分泌的蛋白参与超过40种不同的生物过程，包括代谢和分解代谢过程、对生物或非生物刺激的应激反应、碳水化合物、脂质和蛋白质代谢过程、多细胞生物体发育等。分子功能分类显示植物分泌蛋白组由大量水解酶(~30％)和转移酶(7％~9％)组成，并且大部分具有各种结合活性(~40％)或催化活性(12％~15％)。应当注意的是，因为许多分泌的蛋白质没有被分类在GO中，GO分类仅是每个类别的分布的估计。

表 4 不同植物物种中分泌蛋白的基因本体分类; Gene Ontology classification of secreted proteins in different plant species

表 5 代表性植物物种的分泌物中蛋白质家族的比较; Comparison of protein families in secretomes of representative plant species

使用rpsBLAST在保守结构域数据库(CDD)中搜索Pfam进一步分析分泌蛋白的功能(Marchler-Bauer et al., 2009)。Pfam分析结果中具有20个或更多个成员的物种总结在表5中。Pfams的完整列表可以在补充表1中找到。搜索Pfam的分泌蛋白分子功能的详细分析揭示了不同物种之间的蛋白质家族的差异，包括给定的Pfam和物种特异性Pfam中的成员数目的变化(表5)。值得注意的是，水稻中分泌过氧化物酶蛋白的数量是拟南芥的两倍(表5)。植物过氧化物酶具有多种组织特异性功能，例如从叶绿体和细胞溶质中除去过氧化氢，毒性化合物的氧化，细胞壁的生物合成和针对伤害的防御反应(Sottomayor and Barceló, 2004)。糖基水解酶被认为在修饰植物细胞壁结构和新的生物能源和原料的开发方面有很重要的价值。(Lopez-Casado et al., 2008)。水稻分泌蛋白组由31个成员的Glyco-hydro-18(GH18)和26个GH32N组成，而在拟南芥分泌组织中仅检测到两个GH18和6个GH32N。我们还观察到一些Pfams在水稻中有比在其他物种中更多的成员，这些Pfams包括dirigen-like蛋白，多铜氧化酶，花粉过敏原，细胞色素P450等(表5)。应当注意的是，这些预测的分泌的细胞色素P450蛋白很可能是假阳性，因为到目前没有关于在植物中存在分泌的细胞色素P450蛋白的有实验依据的报道。Wen等(2007)曾报道了豌豆根盖分泌蛋白组中存在细胞色素P450，但是它的存在可能表示在细胞分离过程中发生了泄漏。由于基因组比较小，苔藓物种通常具有较少的分泌蛋白和给定Pfam中的较少的成员数，但是我们发现石松门模式生物卷柏有D-甘露糖结合凝集素家庭的20个成员，而其他植物物种在这个Pfam中除了毛茛包含30个成员，都只有少于10个的成员。我们还观察到了物种特异性分泌蛋白，例如玉米具有30个玉米醇溶蛋白种子储存蛋白成员；小立碗藓(subsp. patens)具有61个具有未知功能的蛋白质成员(DUF4100)。

4讨论

为了给植物研究界提供资源我们构建了PlantSecKB。由UniProtKB或我们策划的给定蛋白质的亚细胞位置被认为是首次分配的亚细胞位置，这些分配基于具有实验证据的可追溯文献，因此相当可靠。但是，基于计算预测分配的亚细胞位置将取决于所使用的工具的精度。我们已经评估了在本研究中使用的方法的预测准确性，并将其与其他方法的准确性进行了比较(表1) (Min, 2010; Meinken and Min, 2012)。我们认为分泌蛋白的预测是相对可靠的，但是仍然存在假阳性和假阴性，例如，许多被预测为分泌蛋白的P450酶很可能是假阳性。

我们还预测了其他亚细胞位置，包括基于TargetP和WoLF PSORT的预测的线粒体，叶绿体，液泡，细胞核等。我们对这些亚细胞位置的预测准确度的评估揭示了我们使用的工具的准确性，尽管它们是可用工具中最好的，但因为这些亚细胞位置的预测灵敏度相对较低，仍然不能令人满意(表1) (Meinken and Min, 2013)。除线粒体和胞质蛋白外，对于叶绿体，ER、高尔基体、细胞核、质膜、液泡和细胞骨架的亚细胞位置特异性是可接受的(>89%)。因此，在那些亚细胞位置预测的蛋白质是相对可靠的，虽然它们仍然需要通过实验验证。最近，几种新工具相继被开发了，包括Cell-PLoc服务器(Chou and Shen, 2008)、MultiLoc2 (Blum et al., 2009)以及其他(Meinken and Min, 2012)。这些工具及其相关出版物可以在我们的网站上找到(http://proteomics.ysu.edu/tools/subcell.html) (Meinken and Min, 2012)。由于其中一些工具不能独立使用，比如Cell-PLoc服务器，一些可以独立使用的工具则太慢，无法处理大型数据集，比如MultiLoc2，我们无法使用它们进行数据处理。但是，我们建议用户使用这些工具获得感兴趣的蛋白质的第二预测，因为我们的经验显示使用多个工具可以改善预测特异性。基于最近对植物中分泌物的大规模研究，观察到非经典的，即无铅分泌蛋白(LSP)被占总的鉴定的分泌蛋白组的50％以上，推测存在独立于经典ER-高尔基分泌途径的新型分泌机制(Agrawal et al., 2010 for review; Jung et al., 2008; Cheng and Williamson, 2010; Ding et al., 2012)。哺乳动物和细菌LSPs已被收集并用预测这些蛋白质的预测软件SecretomeP预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/) (Bendtsen et al., 2004a)。因为该工具未处理过植物特异性数据，无法评估预测植物LSP的准确性，我们没有在数据处理中使用这个工具。

PlantS eKB努力成为植物研究人员搜索植物蛋白，特别是分泌蛋白亚细胞位置的门户， EST子数据库有望促进表达数据的分泌蛋白的EST数据挖掘，这对于未完全测序或仅具有有限数目的cDNA序列的植物物种特别有用。从收集和整理的具有实验依据的植物分泌蛋白，特别是LSP文献来看，植物研究界仍然需要不断努力。我们实施了一个方便人为选择具有实验依据植物蛋白亚细胞位置可通过PlantSecKB访问的管理工具，FunSecKB中描述的实用程序和我们最近实施的真菌分泌蛋白质组知识库(FunSecKB) (Lum and Min, 2011b)提供预期的搜索、下载和管理系统，这将有助于植物研究界进一步了解分泌蛋白质组生物学。它还可以用于探索植物和真菌分泌蛋白的各种潜在作用及其联系、植物病原体控制和抗逆性品种的培育(Kim et al., 2009)。

作者贡献

GL和JM负责数据库，JO和SF进行分泌蛋白的人为选择，XJM设计和构思了整个实验及设数据处理的流程。XJM，JM和GL负责数据的分析和文章的撰写。所有作者阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由俄亥俄植物生物技术联盟 [授权2011-001] (俄亥俄州立大学, 俄亥俄州农业研究和发展中心)和斯敦州立大学(YSU)研究理事会[授权2010-2011和12-11]共同资助。本研究还得到了扬斯敦州立大学(YSU)研究教授以及科学、技术、工程学院的支持，数学院院长将研究的时间分配给XJM。JM由扬斯敦州立大学(YSU)应用化学生物学中心的研究生助手提供支持。

参考文献

Agrawal G.K., Jwa N.S., Lebrun M.H., Job D., and Rakwal R., 2010, Plant secretome: unlocking secrets of the secreted proteins, Proteomics, 10: 799-827

Alexandersson E., Ali A., Resjö S., and Andreasson E., 2013, Plant secretome proteomics, Front. Plant Sci., 4: 9

Bendtsen J.D., Jensen L.J., Blom N., von Heijne G., and Brunak S., 2004a, Feature based prediction of non-classical and leaderless protein secretion, Protein Eng. Des. Sel., 17: 349-356

Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., and Brunak S., 2004b, Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0, J. Mol. Biol., 340: 783-795

Blum T., Briesemeister S., and Kohlbacher O., 2009, MultiLoc2: integrating phylogeny and Gene Ontology terms improves subcellular protein localization prediction, BMC Bioinformatics, 10: 274

Borner G.H., Lilley K.S., Stevens T.J., and Dupree P., 2003, Identification of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins in Arabidopsis. A proteomic and genomic analysis, Plant Physiol., 132: 568-577

Borner G.H., Sherrier D.J., Stevens T.J., Arkin I.T., and Dupree P., 2002, Prediction of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins in Arabidopsis. A genomic analysis, Plant Physiol., 129: 486-499

Boudart G., Minic Z., Albenne C., Canut H., Jamet E., and Pont-Lezica R., 2007, Cell wall proteome, In: Samaj S., and Thelen J. (eds.), Plant Proteomics, Springer, pp.169-185

Bouws H., Wattenberg A., and Zorn H., 2008, Fungal secretomes-nature's toolbox for white biotechnology, Appl. Microbiol. Biotechnol., 80: 381-388

Caccia D., Dugo M., Callari M., and Bongarzone I., 2013, Bioinformatics tools for secretome analysis, Biochim. Biophys. Acta., S1570-9639

Chen X.Y., Kim S.T., Cho W.K., Rim Y., Kim S., Kim S.W., Kang K.Y., Park Z.Y., and Kim J.Y., 2009, Proteomics of weakly bound cell wall proteins in rice calli, J. Plant Physiol., 166: 675-685

Cheng F.Y., and Williamson J.D., 2010, Is there leaderless protein secretion in plants? Plant Signal Behav., 5: 129-131

Cho W.K., and Kim J.Y., 2009, Integrated analyses of the rice secretome, Plant Signal Behav., 4: 345-347

Cho W.K., Chen X.Y., Chu H., Rim Y., Kim S., Kim S.T., Kim S.W., Park Z.Y., and Kim J.Y., 2009, Proteomic analysis of the secretome of rice calli, Physiol. Plant, 135: 331-341

Chou K.C., and Shen H.B., 2008, Cell-PLoc: a package of Web servers for predicting subcellular localization of proteins in various organisms, Nat. protoc., 3(2): 153-162

de Castro E., Sigrist C.J., Gattiker A., Bulliard V., Langendijk-Genevaux P.S., Gasteiger E., Bairoch A., and Hulo N., 2006, ScanProsite: detection of PROSITE signature matches and ProRule-associated functional and structural residues in proteins, Nucleic Acids Res., 34(Web Server issue): W362-365

De-la-Peña C., Badri D.V., Lei Z., Watson B.S., Brandão M.M., Silva-Filho M.C., Sumner L.W., and Vivanco J.M., 2010, Root secretion of defense-related proteins is development-dependent and correlated with flowering time, J. Biol. Chem., 285: 30654-30665

Ding Y., Wang J., Wang J., Stierhof Y.D., Robinson D.G., and Jiang L., 2012, Unconventional protein secretion, Trends Plant Sci., 7: 606-615

Duvick J., Fu A., Muppirala U., Sabharwal M., Wilkerson M.D., Lawrence C.J., Lushbough C., and Brendel V., 2008, PlantGDB: a resource for comparative plant genomics, Nucl. Acids Res., 36: D959-965

Emanuelsson O., Brunak S., von Heijne G., and Nielsen H., 2007, Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools, Nat. Protoc., 2: 953-971

Emanuelsson O., Nielsen H., Brunak S., and von Heijne G., 2000, Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence, J. Mol. Biol., 300: 1005-1016

Finnie C., Andersen B., Shahpiri A., and Svensson B., 2011, Proteomes of the barley aleurone layer: A model system for plant signalling and protein secretion, Proteomics, 11: 1595-1605

Foresti O., and Denecke J., 2008, Intermediate organelles of the plant secretory pathway: identity and function, Traffic, 9: 1599-1612

Gillmor C.S., Lukowitz W., Brininstool G., Sedbrook J.C., Hamann T., Poindexter P., and Somerville C., 2005, Glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins are required for cell wall synthesis and morphogenesis in Arabidopsis, Plant Cell, 17:1128-1140

Greenbaum D., Luscombe N.M., Jansen R., Qian J., and Gerstein M., 2001, Interrelating different types of genomic data, from proteome to secretome: coming in on function, Genome Res., 11: 1463-1468

Hathout Y., 2007, Approaches to the study of the cell secretome, Expert Rev. Proteomics, 4: 239-248

Horton P., Park K.J., Obayashi T., Fujita N., Harada H., Adams-Collier C.J., and Nakai K., 2007, WoLF PSORT: protein localization predictor. Nucleic acids res., 35(Web Server issue): W585-587

Isaacson T., and Rose J.K.C., 2006, The plant cell wall proteome, or secretome, In Plant Proteomics, Annual Plant Reviews Series, edited by Finnie C., Blackwell Publishing, 28:185-209

Jamet E., Albenne C., Boudart G., Irshad M., Canut H., and Pont-Lezica R, 2008, Recent advances in plant cell wall proteomics, Proteomics, 8: 893-908

Jones R.L., and Robinson D.G., 1989, Protein Secretion in Plants, Tansley Review No. 17, New Phytologist, 111: 567-597

Jung Y.H., Jeong S.H., Kim S.H., Singh R., Lee J.E., Cho Y.S., Agrawal G.K., Rakwal R., and Jwa N.S., 2008, Systematic secretome analyses of rice leaf and seed callus suspension-cultured cells: workflow development and establishment of high-density two-dimensional gel reference maps, J. Proteome Res., 7: 5187-5210

Käll L., Krogh A., and Sonnhammer E.L.L., 2007, Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server, Nucleic acids res., 35(Web Server issue): W429-432

Kamoun S., 2009, The Secretome of Plant-Associated Fungi and Oomycetes, In: Deising V.H. (ed.), Plant Relationships, 2nd Edition, The Mycota, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, pp 173-180

Kim S.T., Kang Y.H., Wang Y., Wu J., Park Z.Y., Rakwal R., Agrawal G.K., Lee S.Y., and Kang K.Y., 2009, Secretome analysis of differentially induced proteins in rice suspension-cultured cells triggered by rice blast fungus and elicitor, Proteomics, 9: 1302-1313

Krause C., Richter S., Knöll C., and Jürgens G., 2013, Plant secretome - From cellular process to biological activity, Biochim. Biophys. Acta, 1834(11): 2429-2441

Krogh A., Larsson B., von Heijne G., and Sonnhammer E.L.L., 2001, Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: Application to complete genomes, J. Mol. Biol., 305: 567-580

Kusumawati L., Imin N., and Djordjevic M.A., 2008, Characterization of the secretome of suspension cultures of Medicago species reveals proteins important for defense and development, J. Proteome Res., 7: 4508-4520

Lopez-Casado G., Urbanowicz B.R., Damasceno C.M.B., and Rose J.K.C., 2008, Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage, Current Opinion Plant Biol., 11: 329-337

Lum G., Vanburen R., Ming R., Min X.J., 2013, Secretome prediction and analysis in sacred lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.), Tropical Plant Biol., 6:131-137

Lum G., and Min X.J., 2013, Bioinformatic protocols and the knowledge-base for secretomes in fungi, In: Gupta V.K., Tuohy M.G., Ayyachamy M., Turner K.M. and O’Donovan A. (eds.), Laboratory Protocols in Fungal Biology: Current Methods in Fungal Biology, Springer, pp 545-557

Lum G., and Min X.J., 2011a, Plant secretomes: Current status and future perspectives, Plant Omics J., 4: 114-119

Lum G., and Min X.J., 2011b, FunSecKB: the fungal secretome knowledgebase, Database - J. Biol. Databases Curation, Vol. 2011

Marchler-Bauer A., Lu S., Anderson J.B., Chitsaz F., Derbyshire M.K., DeWeese-Scott C., Fong J.H., Geer L.Y., Geer R.C., Gonzales N.R., Gwadz M., Hurwitz D.I., Jackson J.D., Ke Z., Lanczycki C.J., Lu F., Marchler G.H., Mullokandov M., Omelchenko M.V., Robertson C.L., Song J.S., Thanki N., Yamashita R.A., Zhang D., Zhang N., Zheng C., and Bryant S.H., 2011, CDD: a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins, Nucleic Acids Res., 39(Database issue): D225-229

McCarthy F.M., Wang N., Magee G.B., Nanduri B., Lawrence M.L., Camon E.B., Barrell D.G.,Hill D.P., Dolan M.E., Williams W.P., Luthe D.S., Bridges S.M., and Burgess S.C., 2006, AgBase: a functional genomics resource for agriculture, BMC Genomics, 7: 229

Meinken J., and Min X.J., 2012, Computational prediction of protein subcellular locations in eukaryotes: an experience report. Comput. Mole. Biol., 2(1): 1-7

Melhem H., Min X.J., and Butler G., 2013, The impact of SignalP 4.0 on the prediction of secreted proteins, 2013 IEEE Symposium Series on Computational Intelligence (IIEEE SSCI 2013): The 10th annual IEEE Symposium on Computational Intelligence in Bioinformatics and Computational Biology, Singapore, pp.16-22

Min X.J., 2010, Evaluation of computational methods for secreted protein prediction in different eukaryotes, J. Proteomics Bioinform., 3: 143-147

Min X.J., Butler G., Storms R., and Tsang A., 2005a, OrfPredictor: predicting protein-coding regions in EST-derived sequences, Nucleic Acids Res., 33: W677-680

Min X.J., Butler G., Storms R., and Tsang A., 2005b, TargetIdentifier: a web server for identifying full-length cDNAs from EST sequences, Nucleic Acids Res., 33: W669-672

Ming R., Vanburen R., Liu Y., Yang M., Han Y., Li L.T., Zhang Q., Kim M.J., Schatz M.C.,Campbell M., Li J., Bowers J.E., Tang H., Lyons E., Ferguson A.A., Narzisi G., Nelson D.R., Blaby-Haas C.E., Gschwend A.R., Jiao Y., Der J.P., Zeng F., Han J., Min X.J., Hudson K.A.,Singh R., Grennan A.K., Karpowicz S.J., Watling J.R., Ito K., Robinson S.A., Hudson M.E., Yu Q., Mockler T.C., Carroll A., Zheng Y., Sunkar R., Jia R., Chen N., Arro J., Wai C.M., Wafula E., Spence A., Han Y., Xu L., Zhang J., Peery R., Haus M.J., Xiong W., Walsh J.A., Wu J., Wang M.L., Zhu Y.J., Paull R.E., Britt A.B., Du C., Downie S.R., Schuler M.A., Michael T.P., Long S.P., Ort D.R., Schopf J.W., Gang D.R., Jiang N., Yandell M., Depamphilis C.W., Merchant S.S., Paterson A.H., Buchanan B.B., Li S., Shen-Miller J., 2013, Genome of the long-living sacred lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.), Genome Biol., 14(5): R41

Ngara R., and Ndimba B.K., 2011, Mapping and characterization of the sorghum cell suspension culture secretome, African J. Biotechnol., 10: 253-266

Oh I.S., Park A.R., Bae M.S., Kwon S.J., Kim Y.S., Lee J.E., Kang N.Y., Lee S., Cheong H., and Park O.K., 2005, Secretome analysis reveals an Arabidopsis lipase involved in defense against Alternaria brassicicola, Plant Cell, 17: 2832-2847

Petersen T.N., Brunak S., von Heijne G., and Nielsen H., 2011, SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions, Nature Methods, 8: 785-786

Poisson G., Chauve C., Chen X., and Bergeron A., 2007, FragAnchor a large scale all Eukaryota predictor of Glycosylphosphatidylinositol-anchor in protein sequences by qualitative scoring, Genomics Proteomics Bioinform., 5: 121-130

Ranki H., and Sopanen T., 1984, Secretion of alpha-amylase by the aleurone layer and the scutellum of germinating barley grain, Plant Physiol., 75: 710-715

Rose J.K., and Lee S.J., 2010, Straying off the highway: trafficking of secreted plant proteins and complexity in the plant cell wall proteome, Plant Physiol., 153: 433-436

Shinano T., Komatsu S., Yoshimura T., Tokutake S., Kong F.J., Watanabe T., Wasaki J., Osaki M., 2011, Proteomic analysis of secreted proteins from aseptically grown rice, Phytochemistry, 72: 312-320

Sigrist, C.J.A., Cerutti, L., de Casro, E., Langendijk-Genevaux, P.S., Bulliard, V., Bairoch, A., and Hulo N., 2010, PROSITE, a protein domain database for functional characterization and annotation, Nucleic Acids Res., 38: 161-166

Simpson C., Thomas C., Findlay K., Bayer E., and Maule A.J., 2009, An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking, Plant Cell, 21: 581-594

Sottomayor M., and Barceló A.R., 2004, Plant peroxidases and phytochemistry – foreword, Phytochemistry Rev., 3: 1-2

Tjalsma H., Bolhuis A., Jongbloed J.D., Bron S., and van Dijl J.M., 2000, Signal peptide-dependent protein transport in Bacillus subtilis: a genome-based survey of the secretome, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64: 515-547

von Heijne G., 1990, The signal peptide, J. Membr. Biol., 115: 195-201

Wen F., VanEtten H.D., Tsaprailis G., and Hawes M.C., 2007, Extracellular proteins in pea root tip and border cell exudates, Plant Physiol., 143: 773-783

Werck-Reichhart D., and Feyereisen R., 2000, Cytochromes P450: a success story, Genome Biol., 1: REVIEWS3003

Zhang L., Tian L.H., Zhao J.F., Song Y., Zhang C.J., and Guo Y., 2009, Identification of an apoplastic protein involved in the initial phase of salt stress response in rice root by two-dimensional electrophoresis, Plant Physiol., 149: 916-928